不同美味猕猴桃花粉萌发活力及形态学研究
摘要：为探究猕猴桃花粉萌发活力和花粉萌发前后的形态变化，以 15 份美味猕猴桃花粉为样本，采用离体培养方法测定花粉的萌发活力，利用扫描电镜观察离体培养前后 5 份雌株花粉和 10 份雄株花粉的形态变化。 结果表明：15 份花粉样本萌发率差异较大，5 份雌株花粉均不萌发；10 份雄株花粉中 8 号花粉样本的萌发率最高，为27%；9 号花粉样本的萌发率最低,仅为22. 85%。15份花粉样本离体培养前后扫描电镜观察发现：极面观基本相同，均为三裂圆形：赤道面观有差异，5 份雌株花粉离体培养前后花粉形态不发生改变,均为近球形，而 10 份雄株花粉在萌发前为超长球形或长球形，萌发后均为近球形，极轴长度略有变小、赤道轴长变大、极轴长度与赤道轴长度比值变小、萌发沟宽度增宽,但萌发后的雄株花粉样本间各项形态学指标值差异较小。
关键词
猕猴桃; 花粉; 离体培养; 萌发活力; 形态学
▲picking kiwi flowers
Abstract
In order to investigate the viability of kiwifruit pollen，and to study the morphological changes before and after pollen germination, 15 samples of Actinidia deliciosa pollens were used in this experiment. An in vitro culture method was used to determine pollen germination viability, and scanning electron microscopy was used to observe the morphology of five female pollens and ten male pollens before and after germination. The results showed that the germination rate of pollens from male plants varied considerably.
▲picking kiwi flowers
None of the five female pollens germinated. Among the 10 male pollen samples No. 8 had the highest germination rate of 79.27% and No. 9 had the lowest germination rate of 22.85% . The polar facial view of the 15 samples did not change before and after ex vivo incubation. These samples were all trilobate circles. However, there was a significant difference in their equatorial view. The pollen morphology did not change before and after the female plants were cultured in isolation, and they were all spheroidal. The pollens of the male plant were perprolate or prolate before germination, and after germination in culture in vitro，all 10 samples were sub-spherical，with the polar axis length becoming almost smaller, the equatorial axis length becoming larger, the P/E ratio becoming smaller, and the width of the germination groove becoming larger. The differences in the values of the morphological indexes between the samples were small.
Keywords kiwifruit； pollen； in vitro incubation; germination vigor; morphology
▲猕猴桃花粉萌发情况
猕猴桃是猕猴桃科( Actinidiaceae) 猕猴桃属( Actinidia)的一种优质水果，因其营养丰富、口感独特,深受消费者的喜爱，已成为世界消费量最大的水果之一。 猕猴桃原产于中国，而世界猕猴桃产业的发展却起始于新西兰 20世纪 30年代驯化的美味猕猴桃，虽然我国猕猴桃产业起步晚，但是经过几十年的发展，现已成为世界上猕猴桃产业发展规模最大的国家。猕猴桃是一种雌雄异株植物，其花朵是形态上的二性花，在功能上一般为单性花，通常表现为雄株的花粉可育，雌株的花粉败育，在个体表现上分为雌株和雄株。 目前，猕猴桃主要的栽培品种为中华猕猴桃原变种(A. chinensis var. chinensis)和美味猕猴桃变种( A.chinensis var. deliciosa)，大多是通过传统的杂交育种和实生选种而来的雌株和雄株品种。在生产中，选择优质的雄株花粉可大幅度提高授粉的成功率，花粉活力的高低是雄株花粉优质与否的重要指标。现有花粉活力的测定多选用离体培养的方法观察猕猴桃花粉萌发情况，该方法可以直观有效地定量判定不同花粉活力的高低。关于猕猴桃花粉离体培养萌发，相关学者进行了萌发过程中蔗糖、硼酸等因子的影响、最佳萌发环境条件、花粉采集时期和贮藏条件、散粉规律等方面的研究，但是对花粉萌发前后的形态变化的研究鲜有报道。
▲恒温震荡气育培养箱检测猕猴桃花粉活性
花粉形态稳定且携带大量遗传信息，花粉形态上的差异可进行种间和种内植物的分类研究，已在黄精属(Polygonatum)、秋海棠属(Begonia)、蔷薇花属月季组(R. sect, chinenses)和杨梅属(Maesa)等植物中得到运用,具有积极的参考价值。花粉的萌发过程极其复杂，涉及形态学多项指标的变化，雌雄株花粉在离体培养萌发前后形态变化的相关情况未见报道，为此，本试验以美味猕猴桃花粉为材料，采用离体培养的方法测定不同来源花粉的萌发活力，以期筛选优质的雄株花粉，利用扫描电镜对不同花粉萌发前后的形态进行观察研究，分析猕猴桃花粉萌发过程的形态变化差异，探究花粉萌发的复杂过程，旨为猕猴桃育种及人工授粉提供参考依据。
▲开始培养猕猴桃花粉，准备检测
1
材料与方法
1.1
材料
供试花粉均来源于四川省德阳市什邡市的猕猴桃科研基地，园区土壤为黄壤土，中等肥力，未疏花、疏蕾，常规生产技术统一管理。2022年至2023年春季花期选取不同美味猕猴桃的健康植株进行花粉取样，样本具体信息见表 1。
1.2 方法
1.2.1 花粉收集
采摘不同美味猕猴桃的大蕾期花朵，用镊子轻柔地将花药取出,再将收集的花药于25 ℃恒温烘干24小时，待花粉粒爆出后，将花粉收集于棕色玻璃瓶中，密封保藏于-20 ℃冰箱中备用。
▲Collect kiwi blossoms
1.2.2 花粉活力测定
花粉活力用花粉萌发率表示,使用离体培养法测
定不同猕猴桃花粉的萌发率。 固体培养基配制：蔗糖+硼酸+琼脂，pH 为6.5。 将各花粉样本均匀分撒在培养基表面，25℃恒温培养2h，使用光学显微镜Leica X1进行花粉萌发情况观察和拍照，每个样本选取 6个视野，花粉粒的数量在每个视野中不少于50个，花粉管的长度长于花粉直径，则视为萌发，萌发率计算公式：
萌发率=( 视野中花粉萌发数/视野中花粉总数)×100% 。分别统计供试花粉的萌发率,比较不同美味猕猴桃花粉萌发的差异。
▲正常采摘猕猴桃花蕾
1.2.3
花粉萌发前后的形态观察
萌发前的花粉形态观察方法：用洁净棉签将供试花粉轻柔地粘在导电胶上，喷金镀膜花粉表面 1min后,用日立 SU3500扫描电镜进行形态学观察，选取视野拍照,随机选取 20粒发育正常的花粉,使用 Image J软件和 Excel 软件测量并计算出花粉的萌发沟宽度、极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)共计 4项指标。
▲刚采摘的猕猴桃公花，拿回去开始制花粉了
萌发后的花粉形态观察方法：用刀片划取带萌发花粉的培养基，放置在日立 SU3500扫描电镜的冷冻载物台上，在-25 ℃的条件下真空冷冻观察花粉萌发后的形态并拍照,随机选取 20粒萌发正常的花粉，使用 Image J软件和 Excel 软件测量并计算出花粉的萌发沟宽度、萌发管宽度、极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)共计 5项指标。 本试验中涉及的花粉形状相关分类及学术用语参考文献。
1.3
数据分析使用 Image J 软件测量扫描电镜照片中的花粉形态相关数据,运用 Excel 软件进行数据整理,统计分析利用 IBM SPSS Statistics 20.0 软件进行，使用 GraphPadPrsim 9.5 软件绘制图形。
▲把收集好的花药均匀的摊薄在猕猴桃花粉烘干托盘上
2
结果与分析
2.1
花粉活力测定
15 份供试花粉离体培养 2 h后观察发现：5 份雌花花粉未长出花粉管，不萌发，无活力，不具有可育性；10份雄花花粉均长出花粉管，但是依图 1所见，不同花粉萌发情况不同，8号样本的萌发率最高，为79.27%，显著高于其他 9份花粉样本的萌发率；2 号、3 号、6 号样本的萌发率较高，分别为71.76% 、69.64% 、67.92%，三者之间差异不显著；10号、4号样本的萌发率次之，分别为64.50%、61.09%，二者差异不显著；萌发率较低的样本是 7号、1号、5号样本，萌发率小于50.00%；9 号样本的萌发率为 22.85%，在所有样本中数值最低，与其他 9份样本差异显著。 萌发率最高的 8号和萌发率最低的 9号之间差异很大，二者萌发率相差值为 56.42% 。
▲猕猴桃花粉活性检测
2.2
花粉萌发前后形态学差异分析
如表 1和图 2所示，15份花粉样本在离体培养萌发前后的极面观均为三裂圆形，而赤道面观形态差异较大。 离体培养前，雌株花粉的赤道面观为近球形，雄株花粉的赤道面观为超长球形或长球形。 离体培养后，雌株花粉无花粉管长出，其赤道面观依旧为近球形，而雄株花粉从萌发孔中长出花粉管，形态发生很大改变，其极轴长度、赤道轴长度、极轴长度与赤道轴长度的比值均发生了变化，萌发后的雄株花粉赤道面观均变为近球形。
▲猕猴桃花粉萌发情况
2.2.1 雄株花粉萌发前后极轴长度变化
如图 3 所示，10 份雄株花粉萌发前后极轴长度明显不同。 萌发前，7 号花粉样本的极轴长度明显小于其他样本，极轴长度为(21.58±2.03) μm，其余 9份花粉样本的极轴长度范围在27.00~29.94μm，最大值为3 号样本。 与萌发前相比，除7号花粉样本萌发后极轴长度略有变长外，其余花粉样本极轴长度均明显变短。 萌发后，各样本间的极轴长度差异较小，长度均值范围在 22.13~ 24.49 μm,最大值为 3号样本，最小值为10号样本。
▲猕猴桃花粉萌发情况
2.2.2
雄株花粉萌发前后赤道轴长度变化
如图4 所示，10份雄株花粉萌发后的赤道轴长度明显增长。 萌发前，所有雄株花粉样本的赤道轴长度均小于 20μm，而且各样本间差异较大，长度范围在13.05~16.59μm，最小值为 1号样本，最大值为 7号样本；萌发后，所有样本的赤道轴长度都明显增长，而且长度都在 20μm以上，但各样本间赤道轴长度差异相对较小，长度范围在22.50~25.13μm，最小值为 4号样本，最大值为 3号样本。
▲猕猴桃花粉萌发情况
2.2.3
雄株花粉萌发前后 P/E 比值变化
根据图5所示，花粉萌发后，10 份雄株花粉样本的极轴长度与赤道轴长度的比值( P/E) 均显著降低。萌发前，10份雄株花粉样本间的 P/E 值差异明显，7 号花粉样本 P/E 值最小，为(1.33±0.26) μm，与其余花粉样本差异显著；1 号花粉样本 P/E 值最大，为( 2.22 ±0.24) μm。 萌发前，所有供试花粉样本的 P/E 值均大于 1.14，表示其形状为超长球形或长球形。萌发后，10份雄株花粉样本间 P/E 值差异相对变小，P/E 值范围在0.95~1.03μm，所有花粉的 P/E 值都小于1.14，表示萌发后的花粉形状均为近球形。
▲猕猴桃花粉萌发情况
2.2.4 雄株花粉萌发前后萌发沟宽度变化
如图 6所示，10份供试雄株花粉样本在花粉萌发后的萌发沟宽度明显大于萌发前的宽度，且萌发前后各样本间萌发沟宽度差异较大。 花粉萌发前，萌发沟宽度较小，宽度范围为0.72~2.06μm，最大值为7号样本，最小值为10号样本。 花粉萌发后，萌发沟宽度均大大增加，宽度范围增加到6.27~9.97μm，最大值为10号样本，最小值为2号样本。
▲猕猴桃花粉萌发情况
2.2.5 花粉萌发后萌发管分析
从图 7可以看出，花粉萌发后，10 份供试雄株花粉样本间的萌发管宽度略有差异，萌发管宽度范围在5.28~7.38μm，最大值是 6号样本，5 号样本次之，二者宽度均大于 7.00μm 且二者差异不显著；最小值是 2号样本，8 号样本与 2 号样本差异不显著，二者宽度小于 6.00 μm；其余 6 份样本宽度在 6.00 ~ 7.00 μm，9 号样本值为(6.95±0.67) μm，与其他 5 份样本差异显著，1 号、3 号、4 号、7 号、10 号样本之间差异不显著。
▲packaging kiwipollen
3 讨论与结论
本研究发现，15 份美味猕猴桃花粉离体培养 2 h后，供试样本中 5 份雌株花粉均未长出花粉管，这与猕猴桃雌株花粉不育结论一致；10 份雄株花粉经离体培养后全部萌发，说明 10 份雄株花粉都具有可育性，但是不同雄株花粉的萌发率差异较大，萌发前后花粉形态也发生改变。相同培养时间内，8 号雄株花粉样本的萌发率最高，在供试样本中是最优质的花粉，9 号样本萌发率最低，二者间萌发率相差值为 56.42%。雄株花粉萌发活力过低，会严重影响实际生产中的授粉育种工作，导致减产和降低授粉成功率。 猕猴桃花粉萌发活力对授粉坐果起着关键作用，授粉之前需严格检查花粉活力，挑选优质高活力的雄株花粉进行授粉育种。
▲大基地专用的200克大包装猕猴桃花粉
本试验中的雌雄株花粉培养前后极面观均为三裂圆形，但是赤道面观形态差异较大。雌株花粉离体培养前后形态基本不发生改变，赤道面观均为近球形；雄株花粉萌发前后的形态变化较大，萌发前为超长球形或长球形，萌发后为近球形，说明花粉形态学特征可作为猕猴桃种间资源材料的分类依据之一，该结果与钟敏等的观察结果一致。
▲Red kiwifruit
花粉萌发过程极其复杂，萌发前后10份雄株花粉的萌发沟宽度、极轴长度、赤道轴长度、P/E 值均发生变化，具体表现为萌发后的极轴长度几乎都变小，赤道轴长度均变大，代表花粉形状分级的 P/E 值变小，萌发沟宽度大幅度变宽，但是萌发后10份雄株花粉样本的各项形态学指标彼此间差异不大，特别是 7号花粉样本在萌发前的各项形态学方面的指标与其他 9 份样本差异显著，但是萌发后的差异均显著较小，推断可能是美味猕猴桃种间演化的结果，萌发前形态学上各自存在一定的差异，但是由于其携带的遗传信息很相似，在萌发过程中受到相同调控，使不同美味猕猴桃花粉萌发后的形态学指标都趋于一个差异较小的范围内，这利于授粉时雌花柱头对不同美味猕猴桃雄花花粉的识别和兼容，从而增大授粉成功率。对花粉萌发前后形态变化的推断及具体代谢调控机理有待进一步研究。
▲遵义市播宏猕猴桃果园有限公司是西南地区最大的猕猴桃果业公司，种植1200亩高山猕猴桃，是遵义市农业龙头企业，市级先进扶贫企业。其中猕猴桃花粉项目是中国单体面积最大的猕猴桃花粉园，单个采粉园达到了400亩，丰产期产花粉400公斤，提供高品质、高倍体、高活性的猕猴桃花粉，可以满足30000亩果园的花粉需要。联系微信18030405084
▲Bees pollinate kiwifruit
评论