作者：何子灿1 蔡起贵2 钱迎倩2 黄宏文1 侯云甫
首次报道在光镜下观察美味猕猴桃(品种:No.26原生质体植株的母株)花粉母细胞(PMC)染色体在减数分裂前期的配对,发现其配对和凝缩有明显不同步性。不同细胞间染色体配对形式变化较大,一般以二价联会为主,其次由其它多种配对方式(包括有复合配对、重复配对、着丝点或端粒处联合和多价联会)形成多价体,还有少数未配对或发生内配对(偶见)的单价体和几条二价体之间的次级配对。粗线期观察到少数染色体有缺失(或重复)、倒位、易位和疏松配对等结构性改变。表明该植株是一个复杂的区段异源六位体,少数染色体在结构上累积有变异。还认为该植株是研究减数分裂染色体配对和联会机制的好材料。
▲中科院湖北武汉植物园国家猕猴桃种质量资源圃
多倍体物种的细胞学行为和遗传规律通常与二倍体不同“,”,然而某些异源多倍体由于各个染色体组之间是非同源的。减数分裂染色体配对如同二倍体物种只形成二价体,被称为二倍化的异源多倍体,如棉花、普通小麦”。为了深入了解小麦二倍化的遗传行为,莫兵曾通过对其联会复合体的观察,详细地研究了小麦染色体在减数分裂前期的配对全过程"。现有资料认为美味猕猴桃也是一种二倍化的异源六倍体56)。它的祖先情况不详,染色体多且小,2n=6x= 174,用一般的制片方法很难观察前期染色体的配对情况,它的二倍化细胞学证据仅见于减数分裂中期1(M1)构型。如MNeLage曾报道除偶见1~2个四价体外,均为二价体。
笔者在对原生质体再生植株及其母株的小孢子发育过程的研究中曾报道该母株花粉母细胞第一次减数分裂终变期的染色体凝缩不同步,配对紊乱,构型复杂;对后期1(At)和后期2(A2)染色体异常行为观察结果与前人报道也有不同”,认为有进一步深入探讨的必要,无论是对该植株体细胞无性系变异规律的研究”,还是对促进该物种细胞遗传学的研究都具有重要意义。本研究采用经改进的去壁低渗制片法,首次对其染色体在减数分裂前期配对行为的详细表现进行了直接观察,对染色体组的同源和异源关系提出了新的意见,还对少数染色体的结构变异提供了更精确的细胞学证据。
▲中科院湖北武汉植物园国家猕猴桃种质量资源圃
1 材料和方法
材料同前”,为原生质体植株的母株(A.deliciosa 品种:No.26),由中国科学院植物研究所安和祥教授提供。
当PMC处于减数分裂前期时取花药,固定于 Famer 氏溶液 24h后,转入70%乙醇溶液,置于 6℃冰箱待检。采用改进的去壁低渗法制片,Giem sa染色,O lympusBH光镜观察、摄影。2 结果
21 偶线期染色体配对
呈单一细线状的同源染色体在偶线期开始配对,配对部分染色体发生收缩,染色较深,因染色体太多,造成细线状染色体因密集而不易区分,仅能见部分二价体配对是从一端开始,另一端呈两股细线:有的配对则在染色体全长若干位点同时进行(图版I1);还存在多个染色体之间交替交叉的复合配对。在已配对部分,可辨明为两两相配,遵循配对同源性原则,未能配对的染色体仍呈单一未收缩细线,色浅,表现出染色体凝缩和配对不同步。22 粗线期染色体的配对
此期已联会染色体明显变粗变短,染色加深,但还有染色体继续凝缩和配对不同步。在早粗线期,配对染色体仍较长,与还未配对的细线状染色体相互缠绕,偏于细胞核一侧,呈花束状(图版I2);中粗线期凝缩程度较低的染色体(多为多价体)继续与少数未凝缩的单价体缠绕,集中于染色体图象中间,不易分辨,一些凝缩程度高的二价体多位于图象边沿,易分辨(图版I3),还可见一些单价体向二价体靠拢进行配对。到晚粗线期在n= 87个成员中,能分辨出约80多个成员完成配对(图版14)。
粗线期染色体大多紧密联会,除棒状二价联会外,还能观察到“X”形六价联会,“+”形四价联会,“丫”形三价联会;这些多价体在终变期和M1期可呈环状或链状,如图版I6所示,有环状六价体、环状三价体和链状四价体,此外还有异形二价体之间的次级配对。需指出三价体在该植株PMC中经常出现，曾经在1个PMC中观察到5个三价体(图版17)。
此期最值一提的是在少数已联会的二价体上观察到以下几种自发的染色体结构畸变。①缺失或重复(以后讨论):有中间缺失(图版H9,17a)和末端缺失(图版Ⅱ8)。②倒位和易位:有中间倒位、末端倒位(图版I5)、易位二价体与易位四价体。易位二价体在易位区不能联会(图版H10),易位四价体在双线期呈∞形,易于辨认(图版Ⅱ11)。③疏松配对:疏松配对区可位于染色体一整条臂上(图版H10细箭头)，也可在臂内部分区域(图版H9细箭头)。后一个图象还显示了该二价体在疏松配对部位染色粒的分布有不对称性,反映了一定的染色体结构变异。
同时,该期PMC间配对形式虽无一固定模式,但每一个细胞图象都有多种的配对方式,说明染色体联会是同源染色体之间的随机行为,多倍化增加了它的复杂性。23 双线期配对观察
双细期染色体凝缩更短,已配对染色体开始分离,但于交换处交叉,是研究多价体复杂配对的最佳时期。能观察到由1至几条二价体再各与1条单价体靠近,重复配对形成三价体,新配上的单价体明显比二价体的长(图版H12)。由端粒或着丝粒联合形成的四价体,可见于非核仁染色体(图版I5)和核仁染色体(图版H13)。在后一个图象中还能初步判断出2个同源六价体,1个为“X”型,另1个是由1个核仁四价体与1个核仁二价体组成的6个核仁的染色体。此期有时还见到未联会或环状的单价体,后者显然来源于一等臂染色体的内配对(图版Ⅱ14)。图版H15,16则显示了多个同源或部分同源染色体在不同同源点上相交、相连地牵连成1个复合体情况多处发生。1个同源5价体的配对(图版H18)更进一步表现出它们的联会,遵循同源性原则和每1个交叉点具有两两相配的特征。晚双线期(图版H17)可见到“x”形6价体(图版Ⅱ17b)和“+”形四价体,而其它多价体的配对形式已不易辨认。该图象中可见1个二价体上大的自身折叠(图版H17a),可能源于缺失、重复或外源片断的插入。总之此期图象因配对情况复杂,凝缩并不同步,对相互重迭和缠绕的染色体配对情况仍不易判断。
▲Kiwifruit male flowers
3 讨论
本研究结果显示美味猕猴桃品种:No26 的 PMC染色体配对始于偶线期,染色体的配对和凝缩不同步。除发生二价联会外,还有其它多种配对形式(如重复、复合、端粒或着丝粒联合、多价联会等)形成多价体(有六价体、五价体、四价体、三价体)。这些多价体的形成源于同源染色体配对还是同祖染色体配对呢? 莫兵”通过对小麦联会复合体的发育过程观察,认为小麦(二倍化异源六位体物种)偶线期的确有同祖染色体配对形成的多价体,但在粗线期被消除,只见到二价体;而且在偶线期,同祖多价体的出现频率也远低于同源配对形成的二价体。这些情况显然与我们在本实验观察到的结果有所不同。后者在双线期时染色体复合配对普遍存在,其它形成多价体的配对形式也常见,直到终变期和M:仍有各种类型多价体存在。再结合所观察到的同源六价体和同源五价体情况,有理由认为美味猕猴桃品种:No26的基本染色体组29个染色体成员中,至少有2个或更多一点的成员具有同源群,每个同源群的6个染色体同源,且可形成多种形式的同源多价体。因为从理论上推测,6个同源染色体在配对过程中,由于它们所处的位置不同和任何同源区段只能有2条染色体的联会等原因,有可能出现:1V或3Ⅱ或2Ш或1IV+1Ⅱ,或1H 11I或1V+1I等等情况。综上所述,认为该植物并非像前人所描述的那种二倍化异源六倍体。当然我们也认为可能有同祖染色体存在,如异形二价体之间的次级联会是因其之间有“残余吸引”“”),同时在第1次减数分裂前期时的染色体复合配对多处发生,均反映了部分同质染色体的同源性也可能就是有同祖性,需进一步确证。
然而一直持续到终变期的染色体配对和凝缩不同步,配对紊乱,以二价联会为主,有未能配对的单价体等现象,可能源于种间染色体结构差异所致。为此,笔者又认为美味猕猴桃还具有种间杂种的细胞学特征。Crowhurst"采用RFLP技术后认为至少有2个物种与它的形成有关。杂交和异源多倍体的形成是物种形成的一个重要途径“”,异源多倍体物种的细胞学行为取决于它的几个原始物种之间的系统和分类关系。美味猕猴桃原始祖先虽不知,但它的细胞学行为显然暗示其原始祖先们的染色体组之间，具有一定的同源性程度。根据Stebbins""对多倍体类型的划分,它应属于复杂的区段异源多倍体;该染色体组中只有某些成员与其它染色体组成员同源,而其它成员不同源或部分同源(同祖)。并推测该物种在形成过程中,可能有染色体结构的畸变,其中稳定下来的变异具有重要的进化意义。对它在M，时所反映的多价体不及前期多的现象,笔者认为是由于其染色体太小,配对时交叉少,再随着交叉端化的分离进程,这些多价体被提早消除,或是由于“联会消失”的缘故;当然还有一部分是同祖染色体的配对消失造成。因而,以M1的构型研究这种小染色体的配对情况有一定的局限性和不确切性。
环状三价体和环状单价体的存在表明有完全的等臂染色体,其来源有深究价值。
本研究还表明,双线期能很好进行配对情况的观察,粗线期能研究染色体上累积的结构性变异。有些变异具有遗传上的不稳定性,也为A1和A2时期出现高频率的染色体异常行为所证实”。
被试材料的复杂和丰富的配对形式是研究减数分裂染色体配对和联会机制的好材料。但染色体的配对、联会和分离是一个多步骤的复杂过程,受着复杂的多种因素影响。本研究虽观察到一些现象，但还需采用更多的方法来促进该项研究向更深层次发展。
▲Red heart kiwifruit entering the rapid growth period
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