猕猴桃液体授粉花粉液制备技术研究
Study on the Preparation Technology of Pollen Suspension Liquid for Spray Pollination of Actinidia chinensis
作者：陈建业 李占红 宁玉霞
▲猕猴桃雌花、猕猴桃雄花
【摘要】：为建立猕猴桃液体授粉花粉悬浊液的高效制备方法，以猕猴桃混合雄株花粉和‘豫猕猴桃2号’为试材，进行了利用粗制花粉配制花粉悬浊液及液体授粉试验。结果表明，悬浊液的花粉浓度随粗制花粉添加量的增大而增加；粗制花粉添加量12%~16%(w/v)时，悬浊液的花粉浓度可达125万粒/mL~175万粒/mL，花粉发芽率85%以上，与对照(添加5%精制花粉)无显著性差异；各处理坐果率几乎均为100%；12%以上处理单果重100g左右，种子数1100~1220粒，与对照无显著性差异；4%处理单果重、种子数则显著低于以上处理；不同处理间可溶性固形物含量和酸含量无显著性差异。吸光指数与花粉浓度具有密切线性相关关系(r=0.98)，吸光指数2.5可作为判断花粉浓度是否适宜的指标。该法省去了花粉精制程序，是一种高效省力的猕猴桃人工授粉技术。
▲新西兰果园猕猴桃喷雾湿式授粉
Abstract: To develop the effective preparation methods of pollen suspension for kiwi spray pollination, the author took the mixed pollen and ‘Yumihoutao 2’as materials, and carried out the study by using crude pollen for preparation of pollen suspension and the test of liquid pollination. The test results showed that the pollen concentration of the suspension increased along with the increase of crude pollen added amount. When crude pollen adding amount was 12%-16% (w/v), the pollen concentrations of the suspension was up to 1.25-1.75 million/mL, and the pollen germination rate was more than 85%, and there was no significant difference with controlled trials (add 5% of refined pollen), and the fruit setting rate was almost 100% under each treatment. With crude pollen adding amount of more than 12%, the treated fruit weighed about 100g, the seed number was 1100-1220, and there was no significant difference in comparing with the controlled trials. Fruit weight and seed number of treatment with 4% crude pollen adding amount were significantly lower than that of the above treatments. For soluble solids content and acid content, there was no significant difference between different test treatments. Light absorption index of suspension had a close correlation relationship with pollen concentration (r=0.98), and absorption index of 2.5 could be used as an index for judging pollen concentration be appropriate or not. This method omitted the pollen refined process, and could be a kind of efficient and labor-saving kiwi artificial pollination technique.
Key words: Actinidia chinensis; ‘Yumihoutao 2’; spray pollination; pollen suspension; preparation method
▲采摘的猕猴桃鲜花
猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)属雌雄异株果树，授粉状况直接影响着产量和品质。猕猴桃虽然是风媒花，能够借助风力授粉，但其花粉粒大，在空气中飘浮的距离短，依靠风力授粉效果不好。生产上一般按(5~8):1雌雄株比例配置授粉树，有的甚至高达2:1。增加授粉树有利于坐果及生产大果，但却影响产量。因此，人工授粉对猕猴桃的经济栽培是一项重要操作。国内主要采用对花、毛笔授粉或简易授粉器人工授粉，工效慢，或需多次重复授粉，效果不理想，迫切需要开发省力高效的授粉技术。日本用石松子作填充剂稀释花粉进行喷粉授粉。而石松子是粉末，处理不便，材料成本高，且遇风雨不能作业，或授粉效果显著降低。为此，已有用液体填充剂代替石松子粉的尝试，但在结实稳定性、成本方面尚未达到实用推广地步。矢野隆开发出了利用琼脂作为填充剂的液体授粉技术，并报道了琼脂花粉液的特性及琼脂花粉液添加多胺类物质对花粉发芽的影响。而该技术在调整花粉悬浊液时需使用精制花粉，否则容易堵塞损坏喷雾器，购买精制花粉价格较高，若自制精制花粉，精制步骤繁杂。因此，花粉悬浊液制备的省力化对猕猴桃人工液体授粉是非常重要的。
▲猕猴桃雄株
为简化液体授粉的操作，笔者将经阴干花药散粉后所得粗花粉直接悬浊于液体填充剂中，省略花粉精制工序，探讨了花粉悬浊液高效省力制备方法，并以‘豫猕猴桃2号’品种为试材，调查了该法调制的花粉悬浊液在生产上的实用效果。
1 材料和方法
1.1试验材料
试验用花药采自位于漯河市南郊的猕猴桃园内混合雄株。园地地势平坦，排灌方便，粘壤土，土壤pH
7.5，地下水位5m。人工液体授粉试验在漯河市北郊美锦现代农业园区猕猴桃栽培园进行。2006年春季建园，主栽品种为‘豫猕猴桃2号’，以8:1比例搭配混合雄株，“T”形架整形。
1.2 试验方法
1.2.1花粉悬浊液的配制及花粉浓度和花粉发芽率测定 在授粉前2~3天，选择比主栽品种花期略早生长健壮的雄株，在清晨采集膨大成铃铛形或船形的花朵，采集花药，过2mm(10目)土壤筛去除花丝，立即分别称取各试验处理用鲜花药。试验设5个处理水平：4%（鲜花药重与液体稀释剂容量之比，花药鲜重4g，下同)、12%(12 g)、16%(l6 g)、20%(20g)、对照(0.5%精制花粉)。各处理花药分别平摊于油光纸上，室温下24h使花药自然开裂，即得粗花粉。悬浊液配制前，粗花粉在冰箱中-30℃下冷冻保存。花粉悬浊液的配制方法是：配制加有5%蔗糖的0.1%琼脂溶液；每处理分别量取100mL配制好的琼脂溶液，加入该处理重量的粗花粉，充分振荡后，用120μm孔径的尼龙网筛过滤，滤液即为花粉悬浊液。计量各处理滤液量。
花粉浓度测定，是用血球计数板在显微镜下计测花粉悬浊液中的花粉数，换算为花粉数/mL，每处理重复4次。并用北京普析通用仪器有限责任公司产T6紫外可见光分光光度计测定悬浊液在400nm下的吸光度值，以吸光度值与稀释倍数的乘积作为吸光指数，统计吸光指数与花粉浓度的关系。同时将不同处理花粉悬浊液分别喷雾接种于5%蔗糖+0.1%琼脂培养基上，25℃下培养4h，在显微镜下检测花粉发芽率，每处理3个视野。
▲新西兰果园猕猴桃喷雾湿式授粉
1.2.2 不同处理对坐果和果实生长发育的影响 授粉试验于2012年5月中旬在漯河美锦现代农业园区猕猴桃栽培园进行。试验株为7年生的‘豫猕猴桃2号’。试验处理同前项试验，分别为4%、12%、16%、20%，以0.5%精制花粉为对照，每处理5次重复。试验株5株，每株进行上述5个处理。处理以结果母枝为单位进行，每株喷雾授粉1个结果母枝。花粉悬浊液用前述已制备花粉液。授粉前10天每结果母枝套硫酸纸袋。授粉方法是用手持喷雾器对着花10朵以上的结果母枝于开花期进行喷雾授粉，间隔2天再次授粉。授粉结束后20天去袋调查坐果率，并疏果调整结实量至每结果母枝着果5个。从6月16日至11月5日采收，每隔15天测定果实纵径、横径。采收后测定单果重、可溶性固形物含量(折射式测糖仪)、有机酸含量(未追熟果，追熟果各5果)，调查每果种子数(每处理5果)。有机酸含量测定采用杨文政的方法。
1.2.3 统计分析 对原始数据矩阵减去平均值矩阵与单位矩阵的乘积进行中心化处理，之后，每一中心化数据分别除以同一变量的标准差，得到标准化数据矩阵。采用DPS数据处理系统7.05对标准化数据矩阵据进行方差分析和Duncan多重比较，分析处理间差异显著性。
▲新西兰果园猕猴桃喷雾湿式授粉
2 结果与分析
2.1不同处理花粉悬浊液花粉浓度
由表1可知，0.1%琼脂溶液添加粗制花粉，混匀过滤后所得花粉悬浊液的滤液量，随着添加鲜花药比例增高，滤液得率逐渐降低，4%处理得率为94.6%，而20%处理则为84.9%。这是由于15%左右的溶液被粗花粉所吸收，添加粗花粉越多，花粉悬浊液得率越低。
▲新西兰果园猕猴桃喷雾湿式授粉
相反，花粉浓度(花粉数/mL)则随着添加粗花粉量的增加而成比例增加。以0.5%精制花粉的0.1%琼脂悬浊液为1时，4%处理的相对花粉数为0.24；16%处理的花粉数为175.4万粒/mL，相对花粉数稍高于对照；而20%处理，悬浊液的花粉数则达到234.22万粒/mL，是对照的1.4倍多。方差分析和Duncan多重比较结果，不同处理与4%处理问花粉浓度具有极显著差异，而20%处理花粉浓度极显著地高于其他各处理，但12%、16%处理与对照(0.5%精制花粉)间无显著差异。
2.2 不同处理花粉悬浊液花粉发芽率
花粉发芽试验结果(表1)表明，所有处理的花粉发芽率均较高(77.38%~86.22%)，Duncan多重比较结果，4%处理花粉发芽率与其他处理间具有显著差异，其他各处理问则无显著性差异。各处理花粉悬浊液镜检均未发现花粉吸涨破裂现象。
▲猕猴桃液体授粉花粉液制备技术研究
2.3 悬浊液吸光度与花粉浓度的关系
要获得稳定的授粉效果，悬浊液需达到一定的花粉浓度。考虑到采花雄株、开花期等因素可能会影响悬浊液的花粉数量，采用分光光度法测定悬浊液在400nm波长下的吸光值，以此确定悬浊液的花粉浓度。但因受从花药溶解出的黄色色素的影响难以测出花粉浓度。为此，用0.05%琼脂溶液稀释花粉至不受色素影响的程度，再测定吸光度值，以吸光度值与稀释倍数的乘积作为吸光指数，统计吸光指数与实际测得的花粉浓度间的关系。回归分析结果，吸光指数与实测花粉浓度间的关系可用如下数学模型表示:y=477.34x-141.82，两者间密切相关(r=0.985625,P<0.05)。这表明，可以根据吸光度值来估算花粉浓度(图1)。
▲猕猴桃液体授粉花粉液制备技术研究
2.4 不同粗花粉添加量处理对坐果率的影响
授粉效果调查结果，各处理坐果率几乎均为100%(表2)，表明无论使用粗制花粉还是精制花粉，均可保证满意的坐果效果，但粗制花粉制作简便，更适于生产应用。试验为2次重复授粉，这在生产上会增加工序，增大成本，一次授粉的坐果效果有待进一步试验。
▲猕猴桃液体授粉花粉液制备技术研究
2.5 不同粗花粉添加量处理对果实种子数量和单果重的影响
由表2可知，4%处理的种子数为921粒，其他处理的种子数在1102.2~1221.2粒。方差分析和Duncan多重比较结果，4%处理的单果种子数显著地低于其他各处理；16%处理与12%、20%处理间无显著性差异，但与对照(0.5%精制花粉)间存在显著性差异；对照与12%、20%处理间无显著性差异。
不同处理果实大小见表2。4%处理与12%、对照处理间单果重无显著性差异，与16%和20%处理间具有显著性差异;除4%处理外,其他处理间单果重无显著性差异。
就种子数与单果重的关系来说，回归分析结果表明,猕猴桃种子数与单果重之间存在显著相关关系，即 y=66.9267x+0.02880,r=0.861857,P<0.05。
▲猕猴桃授粉温度
2.6 不同粗花粉添加量处理对果实品质的影响
从不同处理对果实品质的影响看，可溶性固形物含量未追熟果为7.4%~7.8%，追熟果为16%左右；酸含量未追熟果为3g/100mL左右，追熟果为0.7~0.8g/100 mL。无论是未追熟果还是追熟果，各处理间的可溶性固形物含量和酸含量均无显著性差异(表2)。试验结果表明，不同粗花粉添加量处理对果实品质没有明显影响。
▲猕猴桃液体授粉
3 结论
以含有5%蔗糖的0.1%琼脂溶液作为稀释剂制备花粉悬浊液，进行猕猴桃液体授粉，适宜的粗制花粉添加量为12%~16%(w/v)，花粉浓度可达125万粒/mL~175万粒/mL，与对照(0.5%精制花粉悬浊液)花粉浓度相当；花粉发芽率85%左右，坐果率几乎100%，单果重、可溶性固形物含量、酸含量等与对照无显著性差异，每果种子数高于对照。该方法省去了花粉精制工序，是一种省力化猕猴桃人工授粉技术。
▲选择半开的猕猴桃雄花
4讨论
果树栽培的各项管理作业，高效、省力都将是今后的发展趋势，尤其是对于老龄化程度逐年增高，且农村劳动力大量向城市转移，果园管理主要由留守老人承担的中国国情，栽培管理的省力化已成为重要课题。本试验的目的在于简化猕猴桃人工液体授粉时花粉悬浊液制备程序，实现省力化。
笔者研究表明，12%~20%粗花粉添加量等不同处理悬浊液的花粉数为125万粒/mL~234万粒/mL(表1)。在日本，猕猴桃液体授粉通常所用的花粉悬浊液，是将0.5%(w/v)精制花粉稀释于液体填充剂，填充剂基本配方为蔗糖10%+0.08%~0.12%琼脂(或0.1%~0.2%结冻胶)+蒸馏水+精制花粉，悬浊液中含花粉约为70万粒/mL~160万粒/mL。笔者添加12%~16%粗花粉的悬浊液花粉浓度与日本用精制花粉的相当，而添加20%粗花粉时，花粉浓度则高达234万粒/mL。就猕猴桃液体授粉坐果效果来说，本研究各种粗花粉添加量处理都可满足生产实际需要。然而，花粉添加量越大，花药采集投工就越多，会相应增加生产成本。
▲Kiwi pollination by honey bee
一般认为，授粉效果影响果实种子数量，从而影响果实大小凹。郭晓成报道，对猕猴桃来说，一般种子越多，果实越大，风味越好，猕猴桃果实中种子数量与果实大小成正比，相关系数高达0.899，可见要生产单果重100g以上的猕猴桃，需要1000粒以上的种子；一个正常的海沃德果实，其种子数约为1500粒，通过人工授粉，可实现单果重150g左右和果实大小整齐的目标。在猕猴桃果实种子的数量与果实重量的关系方面,本试验的结果与其一致。而刘旭峰等的研究结果，生产重量100g以上的果实需要850粒种子。藤島宏之叫报告需要820粒种子。本试验中4%粗花粉添加量处理的种子数已达920粒，高于刘旭峰等所确定的种子数850和820粒的指标；其他各处理的果实种子数均约为1100~1200粒，种子数量并未随花粉添加量的增加而增多，但均低于郭晓成所提出的每果1500粒的种子数指标。这可能是由于试验所用猕猴桃品种不同。脇孝一等报道，花粉液中花粉浓度越高，单果重越大，种子数量增多。这也与笔者试验结果不尽一致。
▲选择半开的猕猴桃雄花
吸光指数与花粉浓度间存在密切的相关关系(图1)，当花粉悬浊液的吸光指数在2.5以上时，则花粉悬浊液的花粉浓度可达100万粒/mL以上，因此认为，在配制花粉悬浊液时，可将吸光指数2.5作为花粉浓度是否适宜的判断指标。不过，猕猴桃栽培者无论是公司还是农户，每次授粉都要测定吸光度太过不便，因此仍应以粗制花粉的稀释倍数或添加量作为指标为宜。
综上所述，不同粗花粉添加量处理间在花粉发芽率、坐果率、果实品质等方面没有显著性差异，考虑到应用的方便性和生产成本，生产中在配制花粉悬浊液时，粗花粉的使用量应以12%~16%为宜。
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（猕猴桃公树）
（猕猴桃花粉价格）
红心猕猴桃“雄花粉”到底贵不贵？采集花粉和人工授粉的注意事项
初学者如何区分红心猕猴桃公树母树（雄株雌株）掌握这几点事就不难了
2019.10.23中央电视台农业农村频道播出我们公司在贵州山区种植猕猴桃创业者的故事
（猕猴桃授粉）
（猕猴桃授粉）
（猕猴桃授粉）
（猕猴桃花粉制作过程）
▲播宏猕猴桃花粉
（猕猴桃花粉制作过程）
（红心猕猴桃花粉制作过程）
（猕猴桃授粉过程）
（东红猕猴桃授粉）
（东红猕猴桃花粉）
（东红猕猴桃花粉）
（猕猴桃花粉）
（阳光金果G3猕猴桃花粉）
（阳光金果G3花粉）
（黄心猕猴桃花粉）
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